1.对于每个突变位点，依次将突变位点上游序列输入左侧文本框、突变位点突变后的序列输入中部文本框、突变位点下游序列输入右侧文本框。方向均为5'至3'，仅须输入正义链序列即可。

2.点击“生成部分反向互补扩增引物对”按钮，下方文本框内即为该突变位点扩增引物（引物中小写序列即为突变序列）。

3.点击“清空”按钮，继续设计另一个突变位点扩增引物对，直至所有突变位点均完成设计。

注意：

1.突变位点是指目标DNA序列中小于50 bp的一个位置，可以是一个碱基、也可以是多个碱基。

2.向中部文本框输入的突变位点突变后的序列应尽可能短一些，这样可以显著缩短扩增引物的长度。如进行单碱基突变，只需输入一个碱基即可；如进行连续或不连续的多个碱基突变时，例如将NNNaNNNcNNtNNNN序列中的ACT碱基全部突变为G，则将gNNNgNNg输入中部文本框即可。

3.如中部文本框未输入任何序列，可实现左侧文本框序列和右侧文本框序列的无缝拼接，可用于进行载体特定序列的删除。

4.请务必保证：左侧文本框序列+中部文本框序列+右侧文本框序列=完整的突变后序列！否则突变完成后会出现碱基缺失或冗余等错误。

5.不可用于单位点突变引物设计。