1、在顶部单选框内选择适合的载体线性化方式。

2、根据线性化方式输入载体序列并选择酶切位点：

A. 如载体线性化方式为“单酶切线性化”，将载体完整序列或克隆位点附近序列输入至第一个文本框中，并在酶切位点选择列表中选择线性化酶切位点。

B. 如载体线性化方式为“双酶切线性化”，将载体完整序列或克隆位点附近序列输入至第一个文本框中，并在5'和3'在酶切位点选择列表中选择线性化酶切位点。

C. 如载体线性化方式为“PCR扩增线性化”，将载体克隆位点上游序列输入至第一个文本框中，将载体克隆位点下游序列输入至第二个文本框中。

3、将插入片段完整序列输入至下方文本框中，方向5'至3'。

4、点击“生成CE II扩增引物”按钮。下方文本框内即为该插入片段完整正反向扩增引物，每条引物包含重组序列（小写）和特异性扩增序列（大写）两部分。如克隆载体线性化方式为PCR线性化，底部文本框内会显示相应载体扩增引物序列。

5、点击“清空”按钮，继续设计另外一个插入片段的CE II克隆引物。

注：

1. 如果载体线性化方式为单酶切线性化，且酶切位点不唯一，软件默认输入序列中最外端两个酶切位点之间的序列被切除；

2. 如果载体线性化方式为双酶切线性化，软件默认输入序列中两个酶切位点之间的序列被切除；

3. 如果载体线性化方式为PCR扩增线性化，软件默认将插入片段克隆至两输入序列之间。